土壤酶活检测
1、简介
土壤酶是由微生物、动植物活体分泌及动植物残骸分解释放于土壤中的一类具有催化能力的生物活性物质，参与包括土壤生化过程在内的自然界物质循环，在土壤的发生发育及土壤肥力的形成过程中起有重要作用。土壤酶活性作为表征土壤性质的生物活性指标，比常规土壤养分在反映肥力上更加敏感准确。已被广泛应用于评价土壤营养物质的循环转化情况，以及评价各种农业措施和肥料施用的效果。
2、技术路线
土样风干-标线建立-酶促反应-吸光度检测-酶活计算
3、技术特点
美国MD酶标仪，准确性高， 测读准确性：< ±0.006 OD±1.0%，0-2.0 OD；测读精确性：< ±0.003 OD±1.0%，0-2.0 OD；
读板速度快，96孔板：终点法12s， 动力学法最小时间间隔9s。
最大程度上减少实验过程带来的误差。
4、检测指标
序号 | 检测指标 | 样品类别 | 方法 | |
1 | 脲酶 | 土壤样品 | 化学比色法 | |
2 | 碱性磷酸酶 | 土壤样品 | 化学比色法 | |
3 | 过氧化氢酶 | 土壤样品 | 化学比色法 | |
4 | 蔗糖酶 | 土壤样品 | 化学比色法 | |
5 | β-葡萄糖苷酶 | 土壤样品 | 化学比色法 | |
6 | 中性磷酸酶 | 土壤样品 | 化学比色法 | |
7 | 酸性磷酸酶 | 土壤样品 | 化学比色法 | |
8 | 淀粉酶 | 土壤样品 | 土壤淀粉酶检测试剂盒 | |
9 | 酸性转化酶 | 土壤样品 | 土壤酸性转化酶（S-AI）检测试剂盒 | |
10 | 羟胺还原酶 | 土壤样品 | 土壤羟胺还原酶（HR）检测试剂盒 | |
11 | 亚硝酸还原酶 | 土壤样品 | 土壤亚硝酸还原酶检测试剂盒 | |
12 | 过氧化物酶 | 土壤样品 | 土壤过氧化物酶（S-POD）检测试剂盒 | |
13 | 碱性蛋白酶 | 土壤样品 | 土壤碱性蛋白(S-AKP)酶检测试剂盒 | |
14 | 中性蛋白酶 | 土壤样品 | 土壤中性蛋白酶(S-NPT)检测试剂盒 | |
15 | 酸性蛋白酶 | 土壤样品 | 土壤酸性蛋白酶(S-ACP)检测试剂盒 | |
16 | 硝酸还原酶 | 土壤样品 | 土壤硝酸还原酶（S-NR）检测试剂盒 | |
17 | 多酚氧化酶 | 土壤样品 | 土壤多酚氧化酶（PPO）检测试剂盒 | |
18 | α-葡萄糖苷酶 | 土壤样品 | 土壤α-葡萄糖苷酶（S-α-GC）检测试剂盒 | |
19 | 酸性转化酶 | 土壤样品 | 土壤酸性转化酶（S-AI）检测试剂盒 | |
20 | N-乙酰-β-葡萄糖苷酶 | 土壤样品 | 土壤N-乙酰-β-葡萄糖苷酶（S-NAG）检测试剂盒 | |
21 | 纤维素酶 | 土壤样品 | 土壤纤维素酶(S-CL)活性检测试剂盒 | |
22 | 木质素过氧化物酶 | 土壤样品 | 木质素过氧化物酶活性检测试剂盒 | |
23 | 锰过氧化物酶 | 土壤样品 | 土壤锰过氧化物酶（S-Mnp）检测试剂盒 微量法 | |
24 | 漆酶 | 土壤样品 | 土壤漆酶检测试剂盒 微量法 | |
25 | 脱氢酶 | 土壤样品 | 化学比色法 |
1土壤蔗糖酶的测定
1.1原理
蔗糖酶与土壤许多因子有相关性，如与土壤有机质、氮、磷含量、微生物数量及土壤呼吸强度有关。一般情况下，土壤肥力越高，蔗糖酶活性越高。蔗糖酶酶解所生成的还原糖与 3, 5- 二硝基水杨酸反应而生成橙色的3-氨基-5-硝基水杨酸。颜色深度与还原糖量相关，因而可用测定还原糖量来表示蔗糖酶的活性。
1.2试剂
1）8%蔗糖溶液。
2）甲苯。
3）pH 5.5磷酸缓冲溶液。
4）3,5-二硝基水杨酸试剂（DNS试剂）。
5）葡萄糖标准溶液2mg/mL。
1.3实验步骤
1）标准曲线绘制
分别吸葡萄糖标准溶液0、25、50、75、100、125、150、200µL于试管中，再补加蒸馏水至250µL，加DNS试剂0.75mL混匀，于沸水浴中准确反应5min，取出立即冷水浴中冷却至室温。定容至25mL。以空白管调零在波长508nm处比色，以吸光度值为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。
2）土壤蔗糖酶测定
称取2.0000g土壤，置于50mL三角瓶中，加入15mL 8%蔗糖溶液，5mL pH 5.5磷酸缓冲液和5滴甲苯。摇匀混合物后，放入恒温箱，在37℃下培养24h。到时取出，迅速过滤。从中吸取滤液0.25mL于试管中，加0.75mL DNS试剂，在沸腾的水浴锅中加热5min，随即将试管移至自来水流下冷却3min。定容至25mL。在酶标仪上于508nm处进行比色。
为了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖而引起的误差，每一土样需做无基质对照，整个试验需做无土壤对照；如果样品吸光值超过标曲的最大值，则应该增加分取倍数或减少培养的土样。
1.4结果计算
蔗糖酶活性以24h每克干土生成的葡萄糖毫克数表示。
蔗糖酶活性=（a样品－a无土－a无基质）×n/m
a样品、a无土、a无机质分别表示其由标准曲线求得的葡萄糖毫克数；
n——分取倍数；
m——土重。
样品编号 | 称重g | 称重（无基质）g | 浸出液体积mL | 取样mL | Abs测定 | Abs无基质 | △Abs | 含量mg/g |
1 | 2.0440 | 2.0244 | 20 | 0.25 | 0.2576 | 0.0028 | 0.2548 | 23.735 |
2 | 2.0877 | 2.0454 | 20 | 0.25 | 0.3539 | 0.0020 | 0.3519 | 32.489 |
3 | 2.0704 | 2.1452 | 20 | 0.25 | 0.3834 | 0.0039 | 0.3795 | 34.396 |
4 | 2.1232 | 2.1136 | 20 | 0.25 | 0.3427 | 0.0054 | 0.3373 | 30.355 |
5 | 2.0535 | 2.1200 | 20 | 0.25 | 0.3906 | 0.0032 | 0.3874 | 35.478 |
6 | 2.0521 | 2.0507 | 20 | 0.25 | 0.3710 | 0.0055 | 0.3655 | 34.016 |
7 | 2.0788 | 2.0728 | 20 | 0.25 | 0.4259 | 0.0066 | 0.4193 | 38.650 |
8 | 2.0798 | 2.0628 | 20 | 0.25 | 0.3887 | 0.0048 | 0.3839 | 35.415 |
9 | 2.0965 | 2.0879 | 20 | 0.25 | 0.4968 | 0.0060 | 0.4908 | 44.983 |
10 | 2.0669 | 2.0804 | 20 | 0.25 | 0.3342 | 0.0057 | 0.3285 | 30.186 |
1、土样的采集
采集的土壤样品必须具有代表性，要能最大限度地反映其所代 表区域或田块的实际情况。具体采样步骤如下： ①除去地面植被枯枝落叶，铲除表面 1cm 左右的表土，以避免 地面微生物与土样混杂；②取样深度依研究设计而定，在同一剖 面中分层取样时，应在挖好剖面后，先取下层土样，然后再取上 层土样，以避免上下层土样混杂；③多点采样形式：随机布点法 （可采用“之”型采样）、系统布点法（可采用“方格法”）、非 系统布点法（分别按“X、W、N、S”字型的线段布点采样）。 ④ 多点采样时采集质量大致相当的土样于塑料布上，剔除石砾或植 被残根等杂物，混匀后根据研究情况，可只取其中的一部分土样 带回实验室。
2、土样运输与储存
土样从采集位点到实验室内需要经历一定时间的运输。然而， 土样在运输过程中或带回实验室后，原处自然条件发生改变，并 有可能遭受空气中微生物的污染，这就可能引起样品中某些微生 物的消长，进而导致土壤微生物区系发生变化。所以，土样采集 后尽快置于能够自由接触空气的黑暗状态中，并采用能够将土壤 含水量的改变降到最低的方法进行运输。一般条件下，如果需要 保持通气，可采用聚乙烯袋、铝盒、玻璃瓶等可密封的容器；如 果需要保持原状，则需采用铝盒或聚乙烯盒等容器。土样运输过程中应做到：①尽可能保持低温环境，建议使用冰袋维持低温； ②避免长期暴露于光线中（一般建议在黑暗、（4±2）℃并自由接 触空气的条件下冷藏，因为这样可以减少细菌繁殖，维持微生物 区系的稳定，但决不允许出现冷冻、干透或水浸），已减少藻类 等在土壤表面的生长；③尽可能避免物理压实（土样储存一般使 用松散扎口的塑料袋或类似物品，应该注意保证不能将土样进行 大批储存、彼此堆叠，以免在储存器的底部产生厌氧条件。）
样品短期4度保存对微生物影响最小，其次为-80℃冻存，风干保存对微生物影响最大。
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