土壤酶活检测

土壤蔗糖酶的测定

    1.1原理

蔗糖酶与土壤许多因子有相关性，如与土壤有机质、氮、磷含量、微生物数量及土壤呼吸强度有关。一般情况下，土壤肥力越高，蔗糖酶活性越高。蔗糖酶酶解所生成的还原糖与 3, 5- 二硝基水杨酸反应而生成橙色的3-氨基-5-硝基水杨酸。颜色深度与还原糖量相关，因而可用测定还原糖量来表示蔗糖酶的活性。

    1.2试剂

1）8%蔗糖溶液。

2）甲苯。

3）pH 5.5磷酸缓冲溶液。

4）3,5-二硝基水杨酸试剂（DNS试剂）。

5）葡萄糖标准溶液2mg/mL。

    1.3实验步骤

1）标准曲线绘制

分别吸葡萄糖标准溶液0、25、50、75、100、125、150、200µL于试管中，再补加蒸馏水至250µL，加DNS试剂0.75mL混匀，于沸水浴中准确反应5min，取出立即冷水浴中冷却至室温。定容至25mL。以空白管调零在波长508nm处比色，以吸光度值为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。

2）土壤蔗糖酶测定

称取2.0000g土壤，置于50mL三角瓶中，加入15mL 8%蔗糖溶液，5mL pH 5.5磷酸缓冲液和5滴甲苯。摇匀混合物后，放入恒温箱，在37℃下培养24h。到时取出，迅速过滤。从中吸取滤液0.25mL于试管中，加0.75mL DNS试剂，在沸腾的水浴锅中加热5min，随即将试管移至自来水流下冷却3min。定容至25mL。在酶标仪上于508nm处进行比色。

为了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖而引起的误差，每一土样需做无基质对照，整个试验需做无土壤对照；如果样品吸光值超过标曲的最大值，则应该增加分取倍数或减少培养的土样。

    1.4结果计算

蔗糖酶活性以24h每克干土生成的葡萄糖毫克数表示。

蔗糖酶活性=（a样品－a无土－a无基质）×n/m

a样品、a无土、a无机质分别表示其由标准曲线求得的葡萄糖毫克数；

n——分取倍数；

m——土重。

1、土样的采集

采集的土壤样品必须具有代表性，要能最大限度地反映其所代 表区域或田块的实际情况。具体采样步骤如下： ①除去地面植被枯枝落叶，铲除表面 1cm 左右的表土，以避免 地面微生物与土样混杂；②取样深度依研究设计而定，在同一剖 面中分层取样时，应在挖好剖面后，先取下层土样，然后再取上 层土样，以避免上下层土样混杂；③多点采样形式：随机布点法 （可采用“之”型采样）、系统布点法（可采用“方格法”）、非 系统布点法（分别按“X、W、N、S”字型的线段布点采样）。 ④ 多点采样时采集质量大致相当的土样于塑料布上，剔除石砾或植 被残根等杂物，混匀后根据研究情况，可只取其中的一部分土样 带回实验室。

2、土样运输与储存

土样从采集位点到实验室内需要经历一定时间的运输。然而， 土样在运输过程中或带回实验室后，原处自然条件发生改变，并 有可能遭受空气中微生物的污染，这就可能引起样品中某些微生 物的消长，进而导致土壤微生物区系发生变化。所以，土样采集 后尽快置于能够自由接触空气的黑暗状态中，并采用能够将土壤 含水量的改变降到最低的方法进行运输。一般条件下，如果需要 保持通气，可采用聚乙烯袋、铝盒、玻璃瓶等可密封的容器；如 果需要保持原状，则需采用铝盒或聚乙烯盒等容器。土样运输过程中应做到：①尽可能保持低温环境，建议使用冰袋维持低温； ②避免长期暴露于光线中（一般建议在黑暗、（4±2）℃并自由接 触空气的条件下冷藏，因为这样可以减少细菌繁殖，维持微生物 区系的稳定，但决不允许出现冷冻、干透或水浸），已减少藻类 等在土壤表面的生长；③尽可能避免物理压实（土样储存一般使 用松散扎口的塑料袋或类似物品，应该注意保证不能将土样进行 大批储存、彼此堆叠，以免在储存器的底部产生厌氧条件。）

样品短期4度保存对微生物影响最小，其次为-80℃冻存，风干保存对微生物影响最大。