植物酶活检测

1 . 超氧化物歧化酶SOD测定

    1.1实验方法简介

        采用试剂盒测定超氧化物歧化酶SOD

    1.1.1测定原理

        通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子（O2-），O2-可还原氮蓝四唑生成蓝色甲臜，后者在560nm处有吸收；SOD可清除O2-，从而抑制了甲臜的形成；反应液蓝色越深，说明SOD活性愈低，反之活性越高。

    1.1.2试剂

        1）提取液：液体60mL×1瓶，4℃保存；

        2）试剂一：液体15mL×1瓶，4℃保存；

        3）试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存，用时加入27mL蒸馏水，充分摇匀；

        4）试剂三：液体175µL×1支，4℃保存；（与蒸馏水1：1稀释后再用）

        5）试剂四：液体10mL×1瓶，4℃保存。

    1.1.3实验步骤

        1）粗酶液提取

            按照组织质量（g）：提取液体积（mL）为1:5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆，8000g  4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

        2）测定步骤

            I 分光光度计预热30min以上，调节波长至560nm，蒸馏水调零。

            II 测定前将试剂一、二和四 室温放置。

            Ш 在EP 管中加入下列试剂：

充分混匀，室温静置30min后，560nm 处测定各管的吸光值A。

注意事项：

试剂三为酶，不可冷冻，使用时在冰上放置。

对照管只需要做一管。

    1.1.4结果计算

        1）抑制百分率的计算

            抑制百分率=（A对照管-A测定管）÷A对照管×100%

            尽量使样本的抑制百分率控制在30-70%范围内。如果计算出来的抑制百分率小于30%或大于70%，则通常需要调整加样后重新测定。如果测定出来的抑制百分率偏高，则需要将样本用提取液适当稀释；如果测定出来的抑制百分率偏低，则需要重新准备浓度比较高的待测样本。

        2）SOD酶活性单位：在上述黄嘌呤氧化酶耦连反应体系中抑制百分率为50%时，反应体系中的SOD酶活力定义为一个酶活力单位（U/mL）。

        3）组织SOD活性按样本鲜重计算：

            SOD活性（U/g 鲜重）=[抑制百分率÷（1-抑制百分率）×V 反总]÷（W×V样÷V样总）×样本稀释倍数

        式中：

            V反总：反应体系总体积，mL；

            V样：加入反应体系中样本体积，mL；

            V样总：加入提取液体积，mL；

            W：样品质量，g。

2 . 过氧化物酶POD测定

    2.1实验方法简介

        采用试剂盒测定过氧化物酶POD

    2.1.1实验原理

        POD广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，可催化过氧化氢氧化酚类和胺类化合物，具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。POD 催化 H2O2 氧化特定底物，在 470nm有特征光吸收。

    2.1.2试剂

        1）提取液：液体 60mL×1 瓶，4℃保存；

        2）试剂一：液体 60mL×1 瓶，4℃保存；

        3）试剂二：液体0.33mL×2瓶，4℃保存；用时每瓶加入5mL试剂一；用不完的试剂4℃保存一周；

        4）试剂三：液体 10 mL×1 瓶，4℃保存。

    2.1.3实验步骤

        1）粗酶液提取

            按照组织质量（g）：提取液体积（mL）为 1:5~10 的比例（建议称取约0.1g 组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

        2）测定步骤和加样表

测定前将试剂一、二和三25℃放置10min。在1mL玻璃比色皿中按顺序加入上述试剂，

立即混匀并计时，记录470nm下30s时的吸光值A1和1min 30s后的吸光值A2。计算ΔA＝A2-A1。

    2.1.4结果计算

        按样本鲜重计算：

        单位定义：每g组织在每mL反应体系中每分钟使A470变化0.005定义为一个酶活力单位。

        POD（U/g鲜重）=△A×V反总÷（W×V样÷V样总）÷0.005÷T×A

    式中：

        V反总：反应体系总体积，mL；

        V样：加入样本体积，mL；

        V样总：加入提取液体积，mL；

        T：反应时间，min；

        A：稀释倍数；

        W：样品质量，g。

3.1 丙二醛含量测定

    3.1.1实验原理

        MDA与硫代巴比妥酸缩合，生成红色产物，在532nm有最大吸收峰，进行比色后可估测样品中过氧化脂质的含量；同时测定600nm下吸光度，利用532nm与600nm下的吸光度的差值计算MDA的含量。

    3.1.2试剂

        1）提取液：液体60mL×1瓶，4℃保存；

        2）试剂一：液体30mL×1瓶，4℃保存。

    3.1.3实验步骤

        1）粗酶液提取

            按照组织质量（g）：提取液体积（mL）为1:5-10的比例进行冰浴匀浆，8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

        2）测定步骤

            吸取0.6mL试剂一于1.5mL离心管中，再加入0.2mL样本，混匀。

            95℃水浴保温30min，取出置冰水浴冷却，然后10000g，离心10min，

            吸取上清液于1mL比色皿中，测定532nm和600nm处的吸光度，蒸馏水调零，测各管吸光度值。△Abs=A532-A600

    3.1.4结果计算

        组织中MDA含量（nmol/g鲜重）=[△A×V反总÷（ε×d）×109]÷（W×V样÷V样总）

    式中：

        V反总：反应体系总体积，L；

        ε：丙二醛摩尔消光系数，155×103 L/mol/cm；

        d：比色皿光径，1cm；

        V样：加入样本体积，mL；

        V样总：加入提取液体积，mL；

        W：样本质量，g

4.1过氧化氢酶（CAT）测定

    4.1.1测定原理

        过氧化氢酶（CAT）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是最重要的H2O2清除酶，在活性氧清除系统中具有重要作用。

        H2O2在240nm下有特征吸收峰，CAT能够分解H2O2，使反应溶液240nm下的吸光度随反应时间下降，根据吸光度的变化率可计算出CAT活性。

    4.1.2试剂

        1）提取液：液体 60mL×1 瓶，4℃保存；

        2）试剂一：液体60mL×1 瓶，4℃保存；

        3）试剂二：液体100μL×3瓶，4℃保存，

    4.1.3实验步骤

        1）粗酶液提取

            按照组织质量（g）：提取液体积（mL）为1:5-10的比例进行冰浴匀浆，8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

        2）测定步骤

            1、分光光度计预热30min以上，调节波长至240nm处，蒸馏水调零。

            2、CAT检测工作液的配置：用时在每瓶试剂二（100μL）中加入20mL试剂一，充分混匀，作为工作液；用不完的试剂4℃保存一周。

            3、测定前将CAT检测工作液25℃水浴10min。

            4、取1mLCAT检测工作液于1mL石英比色皿中，再加入35μL样本，混匀5s；室温下立即测定240nm下的初始吸光值A1和1min后的吸光值A2。计算△Abs=A1-A2

    4.1.4结果计算

        单位定义：每g组织在反应体系中每分钟催化1nmol H2O2降解定义为一个酶活力单位。

        组织中CAT含量（U/g鲜重）=[△A×V反总÷（ε×d）×109]÷（W×V样÷V样总）÷T

    式中：

        V反总：反应体系总体积，L；

        ε：H2O2摩尔消光系数，4.36×104 L/mol/cm；

        d：比色皿光径，1cm；

        V样：加入样本体积，mL；

        V样总：加入提取液体积，mL；

        W：样本质量，g

        T:反应时间，1min

取样方法

1、样品类型

▶   细胞，取样后离心，去除培养基，立即放入液氮中，之后-80°保存。

▶   叶片、茎、花等，取下后立即放入液氮中，之后-80°保存。

▶   果实的果肉、果皮等，如果野外现场不具备分离条件，需尽快(30MIN内)转移至室内，分离样品放入液氢中，之后-80°保存。

2、混合取样

▶   每份样品混合来自至少3株以上的组织。以水稻叶片为例：取同一时期，表型基本一致的，同一个部位的1片叶片，同时取6株，放到的10M离心管中，并迅速放入液氮中。

3、样品重量和重复

▶   新鲜的、干净的植物样品(鲜样)，样本建议量>1G，最少量>0.6G。准备3份及以上生物学重复。

4、储存和运输

▶   采摘样品后立即用液氨速冻统一使用5ML或15ML质量较好的离心管(根据样本类型、大小选择离心管规格)装入样品，需足量的干冰运输至公司。所有盛装样品的管子需在常温下用记号笔清晰标注样品名称(勿在冷冻温度下标注)。另外，由于植物对损伤的应激反应会影响植物激素含量，为得到准确并符合预期的结果，尽量减少植物样品在常温下的暴露时间。

样本建议3个生物学重复