1 . 超氧化物歧化酶SOD测定
1.1实验方法简介
采用试剂盒测定超氧化物歧化酶SOD
1.1.1测定原理
通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子(O2-),O2-可还原氮蓝四唑生成蓝色甲臜,后者在560nm处有吸收;SOD可清除O2-,从而抑制了甲臜的形成;反应液蓝色越深,说明SOD活性愈低,反之活性越高。
1.1.2试剂
1)提取液:液体60mL×1瓶,4℃保存;
2)试剂一:液体15mL×1瓶,4℃保存;
3)试剂二:粉剂×1瓶,4℃保存,用时加入27mL蒸馏水,充分摇匀;
4)试剂三:液体175µL×1支,4℃保存;(与蒸馏水1:1稀释后再用)
5)试剂四:液体10mL×1瓶,4℃保存。
1.1.3实验步骤
1)粗酶液提取
按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆,8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
2)测定步骤
I 分光光度计预热30min以上,调节波长至560nm,蒸馏水调零。
II 测定前将试剂一、二和四 室温放置。
Ш 在EP 管中加入下列试剂:
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 |
试剂一 | 240 | 240 |
试剂二 | 510 | 510 |
试剂三 | 6 | 6 |
样本 | 90 | / |
试剂四 | 180 | 180 |
蒸馏水 | / | 90 |
充分混匀,室温静置30min后,560nm 处测定各管的吸光值A。
注意事项:
试剂三为酶,不可冷冻,使用时在冰上放置。
对照管只需要做一管。
1.1.4结果计算
1)抑制百分率的计算
抑制百分率=(A对照管-A测定管)÷A对照管×100%
尽量使样本的抑制百分率控制在30-70%范围内。如果计算出来的抑制百分率小于30%或大于70%,则通常需要调整加样后重新测定。如果测定出来的抑制百分率偏高,则需要将样本用提取液适当稀释;如果测定出来的抑制百分率偏低,则需要重新准备浓度比较高的待测样本。
2)SOD酶活性单位:在上述黄嘌呤氧化酶耦连反应体系中抑制百分率为50%时,反应体系中的SOD酶活力定义为一个酶活力单位(U/mL)。
3)组织SOD活性按样本鲜重计算:
SOD活性(U/g 鲜重)=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V 反总]÷(W×V样÷V样总)×样本稀释倍数
式中:
V反总:反应体系总体积,mL;
V样:加入反应体系中样本体积,mL;
V样总:加入提取液体积,mL;
W:样品质量,g。
2 . 过氧化物酶POD测定
2.1实验方法简介
采用试剂盒测定过氧化物酶POD
2.1.1实验原理
POD广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,可催化过氧化氢氧化酚类和胺类化合物,具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。POD 催化 H2O2 氧化特定底物,在 470nm有特征光吸收。
2.1.2试剂
1)提取液:液体 60mL×1 瓶,4℃保存;
2)试剂一:液体 60mL×1 瓶,4℃保存;
3)试剂二:液体0.33mL×2瓶,4℃保存;用时每瓶加入5mL试剂一;用不完的试剂4℃保存一周;
4)试剂三:液体 10 mL×1 瓶,4℃保存。
2.1.3实验步骤
1)粗酶液提取
按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约0.1g 组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
2)测定步骤和加样表
试剂名称(µL) | 测定孔 |
样本 | 15 |
蒸馏水 | 270 |
试剂一 | 520 |
试剂二 | 130 |
试剂三 | 135 |
测定前将试剂一、二和三25℃放置10min。在1mL玻璃比色皿中按顺序加入上述试剂,立即混匀并计时,记录470nm下30s时的吸光值A1和1min 30s后的吸光值A2。计算ΔA=A2-A1。
2.1.4结果计算
按样本鲜重计算:
单位定义:每g组织在每mL反应体系中每分钟使A470变化0.005定义为一个酶活力单位。
POD(U/g鲜重)=△A×V反总÷(W×V样÷V样总)÷0.005÷T×A
式中:
V反总:反应体系总体积,mL;
V样:加入样本体积,mL;
V样总:加入提取液体积,mL;
T:反应时间,min;
A:稀释倍数;
W:样品质量,g。
3.1 丙二醛含量测定
3.1.1实验原理
MDA与硫代巴比妥酸缩合,生成红色产物,在532nm有最大吸收峰,进行比色后可估测样品中过氧化脂质的含量;同时测定600nm下吸光度,利用532nm与600nm下的吸光度的差值计算MDA的含量。
3.1.2试剂
1)提取液:液体60mL×1瓶,4℃保存;
2)试剂一:液体30mL×1瓶,4℃保存。
3.1.3实验步骤
1)粗酶液提取
按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5-10的比例进行冰浴匀浆,8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
2)测定步骤
吸取0.6mL试剂一于1.5mL离心管中,再加入0.2mL样本,混匀。
95℃水浴保温30min,取出置冰水浴冷却,然后10000g,离心10min,
吸取上清液于1mL比色皿中,测定532nm和600nm处的吸光度,蒸馏水调零,测各管吸光度值。△Abs=A532-A600
3.1.4结果计算
组织中MDA含量(nmol/g鲜重)=[△A×V反总÷(ε×d)×109]÷(W×V样÷V样总)
式中:
V反总:反应体系总体积,L;
ε:丙二醛摩尔消光系数,155×103 L/mol/cm;
d:比色皿光径,1cm;
V样:加入样本体积,mL;
V样总:加入提取液体积,mL;
W:样本质量,g
4.1过氧化氢酶(CAT)测定
4.1.1测定原理
过氧化氢酶(CAT)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,是最重要的H2O2清除酶,在活性氧清除系统中具有重要作用。
H2O2在240nm下有特征吸收峰,CAT能够分解H2O2,使反应溶液240nm下的吸光度随反应时间下降,根据吸光度的变化率可计算出CAT活性。
4.1.2试剂
1)提取液:液体 60mL×1 瓶,4℃保存;
2)试剂一:液体60mL×1 瓶,4℃保存;
3)试剂二:液体100μL×3瓶,4℃保存,
4.1.3实验步骤
1)粗酶液提取
按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5-10的比例进行冰浴匀浆,8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
2)测定步骤
1、分光光度计预热30min以上,调节波长至240nm处,蒸馏水调零。
2、CAT检测工作液的配置:用时在每瓶试剂二(100μL)中加入20mL试剂一,充分混匀,作为工作液;用不完的试剂4℃保存一周。
3、测定前将CAT检测工作液25℃水浴10min。
4、取1mLCAT检测工作液于1mL石英比色皿中,再加入35μL样本,混匀5s;室温下立即测定240nm下的初始吸光值A1和1min后的吸光值A2。计算△Abs=A1-A2
4.1.4结果计算
单位定义:每g组织在反应体系中每分钟催化1nmol H2O2降解定义为一个酶活力单位。
组织中CAT含量(U/g鲜重)=[△A×V反总÷(ε×d)×109]÷(W×V样÷V样总)÷T
式中:
V反总:反应体系总体积,L;
ε:H2O2摩尔消光系数,4.36×104 L/mol/cm;
d:比色皿光径,1cm;
V样:加入样本体积,mL;
V样总:加入提取液体积,mL;
W:样本质量,g
T:反应时间,1min
SOD酶活力 | POD酶活力 | MDA酶活力 | CAT酶活力 | |
样品名称 | (U/g鲜重) | (U/g鲜重) | (nmol/g) | (U/g) |
154 | 189.505 | 191076.815 | 16.913 | 150.562 |
157 | 150.008 | 149800.000 | 9.108 | 146.288 |
160 | 242.990 | 102834.016 | 12.163 | 145.934 |
161 | 185.456 | 134936.285 | 10.473 | 187.663 |
162 | 274.655 | 137605.484 | 10.614 | 188.304 |
163 | 122.440 | 88950.067 | 11.144 | 146.449 |
165 | 184.585 | 145627.220 | 8.684 | 174.982 |
166 | 321.184 | 196175.253 | 8.946 | 228.585 |